近日，我院邵世鹏教授研究团队与西南大学张宏晨研究团队合作在RNA单分子成像领域取得重要突破，成功开发出一种名为CDegSR（CRISPR-mediated Degron-based Signal Restoration）的紧凑型高保真RNA成像平台。研究成果以题为“Single‐Molecule Imaging of Endogenous RNA Using a Miniaturized and Circularly Permuted CRISPR‐Cas13 System”的论著形式发表在Advanced Science上。该技术通过蛋白质工程与条件性蛋白稳定性调控的巧妙结合，首次实现了对内源性RNA在活细胞中的高信噪比单分子实时追踪，为解析基因表达的时空动态提供了重要的研究工具。

活细胞中RNA的动态行为是基因表达调控的核心环节，但传统RNA成像技术面临严峻挑战。基于荧光蛋白的成像系统背景信号高、信噪比低，难以分辨单个RNA分子；而基于CRISPR-Cas13的成像工具虽具备可编程性，却因效应蛋白体积庞大（约130–150 kDa），对目标RNA产生显著的空间位阻，且难以通过腺相关病毒等小容量载体进行高效递送。如何实现对内源性RNA的低扰动、高灵敏、单分子级成像，是该领域长期悬而未决的核心难题。

针对上述瓶颈，研究团队从蛋白质结构工程入手，基于冷冻电镜解析的PspCas13b-crRNA-tgRNA三元复合物结构，系统性地删除了dPspCas13b的HEPN1和HEPN2核酸酶结构域，将效应蛋白精简至约70 kDa的最小识别核心（REC lobe），命名为miniCas13。这一精简不仅将蛋白尺寸压缩至传统Cas13的一半，还显著降低了其对目标RNA的位阻干扰，并提升了成像的持续稳定性。

然而，精简后的miniCas13仍为“常亮型”荧光蛋白，未结合的游离效应器会产生大量背景噪声。研究团队进一步引入环状排列（Circular Permutation）策略，将蛋白的天然末端通过柔性连接子融合，并在靠近RNA结合界面的位点（第423位氨基酸）重新开辟新的末端。在此基础上，在新末端融合了富含精氨酸的降解信号（RRRG degron），使未结合目标RNA的效应蛋白被蛋白酶体迅速降解，而结合RNA后降解信号被空间位阻所遮蔽，蛋白得以稳定保留。这一“靶标结合即稳定”的条件性调控机制，使CDegSR实现了高达二十倍的荧光诱导倍数，信噪比相比传统dCas13系统实现了质的飞跃。

在单分子成像应用层面，研究团队设计了针对POLR2A（RNA聚合酶II最大亚基）mRNA的24条crRNA组合，通过慢病毒文库高效共递送，实现单个mRNA分子上多价CDegSR效应器的协同招募，足以突破衍射极限实现单分子分辨率。正交验证实验表明，CDegSR标记的荧光puncta与单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）信号高度共定位，皮尔逊相关系数达0.77，假阳性率和假阴性率均低于10%，且标记本身不改变目标RNA的表达丰度与周转速率。研究团队还成功将该技术应用于多种RNA类型的成像，包括NEAT1、7SK、SatIII以及表达丰度极低（nTPM=5.2）的ZNF530 mRNA，充分证明了CDegSR系统的普适性与灵敏度。

利用CDegSR平台，研究团队在活细胞中对POLR2A mRNA进行了高频单分子追踪，首次定量揭示了细胞核与细胞质中mRNA扩散行为的显著差异。核内mRNA呈现次扩散或受限运动特征，提示染色质结构、核体与蛋白质网络构成的密集核环境对转录本施加了物理约束；而胞质mRNA则运动更为自由。进一步研究发现，使用嘌呤霉素抑制翻译后，mRNA的跳跃距离、扩散系数、异常扩散标度因子及分形维数均发生显著变化，表明翻译机器本身参与调控mRNA的扩散行为。这一发现为理解mRNA在胞质中的命运调控提供了全新的视角。

该研究工作得到国家自然科学基金、重庆市自然科学基金、重庆英才等多项基金的资助。

全文链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.77533